來自ATCC的細胞培養(yǎng)指南（精簡版）

每天對待細胞那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丟了。如果手里有一份來自機構(gòu)ATCC的《細胞培養(yǎng)指南》，養(yǎng)細胞可就得心應(yīng)手多了。下面是細胞培養(yǎng)指南（精簡版），值得收藏。

   綜述

細胞要么在培養(yǎng)瓶表面貼壁生長（錨定依賴性）要么懸浮生長（非錨定依賴性）。細胞的生長和分裂，通常遵循一個由四個階段組成的特征性增長模式：停滯期，對數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺期）和衰退期。

停滯期——將細胞接種至培養(yǎng)瓶之后，細胞逐步恢復(fù)的同時，緩慢生長。

對數(shù)期（指數(shù)期）——細胞進入一個對數(shù)生長的時期，一直持續(xù)到整個生長表面被占滿或細胞密度超過培養(yǎng)基提供營養(yǎng)的能力。

平穩(wěn)期——細胞增殖減慢或停止。

衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細胞數(shù)量不減少，細胞活力會下降，并出現(xiàn)細胞死亡。

為了確?；盍?，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細胞保持在對數(shù)期。這意味著細胞需要在進入平穩(wěn)增長階段之前，或在單層細胞長成100%融合之前，或在懸浮細胞達到推薦的最大細胞密度之前定期進行傳代培養(yǎng)。為每個細胞系繪制生長曲線，對于測定該細胞系的生長特性是必要的。

~凍存細胞復(fù)蘇~

培養(yǎng)一個新的細胞時要特別注意培養(yǎng)基一致性的問題。雖然大多數(shù)細胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，但是當(dāng)培養(yǎng)基改變時，細胞的性質(zhì)也會變化。來自于不同廠家的培養(yǎng)基，即使名字相同或類似，配方也略有差異。仔細閱讀說明書，配方，標(biāo)簽，確保使用正確的培養(yǎng)基。

細胞復(fù)蘇時，應(yīng)以最快速度融化凍存的細胞溶液，然后迅速與*培養(yǎng)基混合，并接種到合適的細胞瓶中。

復(fù)蘇程序

1) 準(zhǔn)備細胞培養(yǎng)容器（如T-75細胞瓶），加入至少10 ml適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，并平衡溫度及pH。

2) 從液氮罐中取出凍存管，并在37℃（或適合該細胞的溫度）水浴中緩慢搖動至冰晶*融化（約2 min），注意解凍過程要迅速。

3) 從水浴中取出凍存管，浸泡或者噴撒酒精消毒。后續(xù)的操作，需在無菌操作臺中，并保證嚴(yán)格無菌。

4) 擰開凍存管蓋，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有9ml*培養(yǎng)基的無菌離心管中。溫和離心(125g×10min)，棄去上清去除凍存保護劑。注意不要擾動細胞層。加入1-2 ml*培養(yǎng)基重懸細胞，緩慢吹打使細胞團變松散。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)基的容器中充分混合。

5) 24小時后，檢測細胞狀態(tài)。

細胞傳代培養(yǎng)~

單層貼壁細胞的傳代培養(yǎng)

為了保證單層貼壁細胞的對數(shù)生長，需要定期傳代。當(dāng)細胞生長接近指數(shù)生長后期(匯合率大約70%到90%)，準(zhǔn)備傳代。針對傳代過程，ATCC提供的產(chǎn)品說明中，會推薦細胞傳代分配比例和補充培養(yǎng)基策略。

單層貼壁細胞傳代，需要打斷細胞之間的連接。對于比較松散的連接，猛擊培養(yǎng)瓶側(cè)壁，可以分離細胞。很多情況下，需要/EDTA的蛋白水解酶來消化。對于一些細胞系，需要采用刮等機械方法分離細胞。細胞分離成為單細胞懸液后，稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏炔⑥D(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中，細胞將再貼壁生長和分裂。

由于每種細胞都是的，孵化時間和溫度、清洗次數(shù)或溶液配方可能會有所不同。分離過程中，應(yīng)用顯微鏡密切觀察細胞，以防止細胞損傷。這個過程根據(jù)容器使用合適的培養(yǎng)體積。

懸浮細胞的傳代培養(yǎng)

相對于單層貼壁細胞來說，懸浮細胞的傳代更具有優(yōu)勢，單層貼壁細胞需要蛋白水解酶，會造成細胞損傷。而懸浮細胞可以使用稀釋的方法來傳代，細胞生長沒有延遲，對實驗室空間要求較小，傳代培養(yǎng)是線性放大的。比如細胞可以在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。

根據(jù)細胞類型，懸浮培養(yǎng)接種密度從2×10*4至5×10*5活細胞/ml。收獲時細胞密度2×10*6細胞/ml。如果細胞接種密度過低，他們將經(jīng)歷增長延遲階段，增長非常緩慢甚至*死亡。如果細胞密度過高，細胞可能耗盡培養(yǎng)基中營養(yǎng)，而突

~細胞凍存~

隨著細胞被冷凍至冰點以下，懸液中冰晶和溶質(zhì)的濃度有所增加。如果冷卻過程中，胞內(nèi)水分可以滲出細胞，則可以減少胞內(nèi)冰晶。通常1℃/min的降溫速度可以促進此過程。但是，水分的喪失會導(dǎo)致細胞收縮，當(dāng)這種收縮達到一定程度，又會導(dǎo)致細胞活性的劇烈下降。冷凍保護劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO），可以緩解這種效應(yīng)。細胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)程序是在含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基中，將細胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中以保持低于–130℃的環(huán)境。

有很多方法可以實現(xiàn)1℃/min的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是好的方式，可以精確保持降溫速度。這也是ATCC采用的方法。但這種設(shè)備價格較高。比較經(jīng)濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃的冰箱中凍存24小時。之后再轉(zhuǎn)移至液氮長期儲存。

以下程序適用于大多數(shù)細胞。凍存培養(yǎng)基的配方請參考細胞說明書。凍存時，細胞應(yīng)處于指數(shù)生長期。

凍存程序

1) 凍存前先檢測細胞是否受到細菌、真菌、支原體和病毒的污染。如果確定有污染，應(yīng)將該細胞銷毀。

2) 凍存培養(yǎng)基由*培養(yǎng)基和5%D